Le tossine della nucleotidiltransferasi MenT estendono gli steli dell'accettore del tRNA e possono essere inibite dal legame asimmetrico dell'antitossina

Nature Communications volume 14, numero articolo: 4644 (2023) Citare questo articolo

1087 accessi

21 Altmetrico

Dettagli sulle metriche

Mycobacterium tuberculosis, il batterio responsabile della tubercolosi umana, ha un genoma che codifica un numero notevolmente elevato di sistemi tossina-antitossina con funzione in gran parte sconosciuta. Abbiamo recentemente dimostrato che il genoma di M. tuberculosis codifica quattro di una diffusa famiglia MenAT di sistemi tossina-antitossina nucleotidiltransferasi. In questo studio caratterizziamo MenAT1, utilizzando il sequenziamento del tRNA per dimostrare l'attività di modifica del tRNA di MenT1. L'attività di MenT1 è bloccata da MenA1, un'antitossina proteica corta non correlata alla chinasi MenA3. L'analisi cristallografica a raggi X mostra il blocco della piega MenT conservata mediante il legame asimmetrico di MenA1 attraverso due protomeri MenT1, formando un complesso eterotrimerico tossina-antitossina. Infine, dimostriamo anche la modificazione del tRNA da parte della tossina MenT4, indicando un'attività conservata in tutta la famiglia MenT. Il nostro studio evidenzia la variazione nelle preferenze del target del tRNA da parte delle tossine MenT, l'uso selettivo di substrati nucleotidici e diverse modalità di attività dell'antitossina MenA.

I sistemi tossina-antitossina (TA) comprendono piccoli moduli genetici che codificano una tossina nociva e la sua antitossina antagonista. Sono diffusi nei genomi batterici e archeologici e sugli elementi genetici mobili e sono generalmente inducibili dallo stress1,2,3,4,5. I sistemi TA hanno un ruolo nella difesa contro l'infezione dei fagi, nel mantenimento delle regioni genomiche e, in alcuni casi, contribuiscono alla virulenza batterica e alla persistenza degli antibiotici4,6,7,8,9. È stato dimostrato che in condizioni di crescita indulgenti, l’attività della tossina è bloccata dalla sua antitossina affine e la crescita batterica non viene influenzata. Tuttavia, in condizioni specifiche come l'infezione fagica o la perdita di plasmidi, l'equilibrio tra tossina e antitossina è disregolato. Di conseguenza, le tossine libere prendono di mira processi o strutture cellulari essenziali, tra cui la traduzione, la replicazione, il metabolismo o l'involucro cellulare, causando l'inibizione della crescita o la morte cellulare2,10.

Mycobacterium tuberculosis, il batterio responsabile della tubercolosi umana, ha un genoma che codifica una notevole abbondanza di oltre 86 sistemi TA11,12. Questa suite di sistemi AT include molteplici esempi di famiglie AT ben conservate, che hanno generalmente dimostrato di essere indotte in condizioni di stress rilevanti, tra cui ipossia, fagocimento di macrofagi o esposizione ad antibiotici13,14. Molte delle presunte tossine di M. tuberculosis hanno dimostrato di essere tossiche quando espresse in M. tuberculosis, M. smegmatis e/o E. coli, mentre il loro effetto deleterio è stato efficacemente inibito dalla co-espressione della corrispondente antitossina13,15. Di conseguenza, è stato proposto che le tossine attivate possano modulare la crescita del M. tuberculosis in determinate condizioni, contribuendo così alla sopravvivenza nell'ospite umano11,15,16. Tuttavia, ad eccezione di una manciata di sistemi TA che sono stati testati e hanno dimostrato di contribuire all’infezione dell’ospite17,18,19, la loro funzione cellulare rimane in gran parte sconosciuta. Inoltre, la natura altamente tossica di alcune di queste tossine suggerisce che i loro meccanismi antibatterici potrebbero essere utilizzati per identificare nuovi bersagli farmacologici o, in alternativa, tramite applicazione diretta come antimicrobici intracellulari20,21,22,23,24.

I membri della famiglia MenAT dei sistemi TA nel M. tuberculosis codificano una tossina con un dominio proteico simile alla nucleotidiltransferasi (NTasi) conservato (DUF1814) e un'antitossina affine, che può appartenere a diverse famiglie di proteine25,26. Tra i membri della famiglia MenAT di M. tuberculosis, MenT1 (Rv0078A), MenT3 (Rv1045) e MenT4 (Rv2826c) hanno dimostrato di inibire la crescita di M. smegmatis quando sovraespressi, mentre MenT2 (Rv0836c) non ha mostrato alcun effetto rilevabile25. Le tossine MenT appartengono alla famiglia delle proteine ​​di infezione abortiva (AbiEii) di Streptococcus agalactiae che contengono quattro motivi distintivi conservati26. I motivi N-terminali I e II si trovano nella DNA polimerasi β e si propone di coordinare uno ione metallico per il legame e il trasferimento dei nucleotidi. Il motivo III C-terminale è simile a quello delle NTasi tRNA che aggiungono il motivo 3' CCA ai tRNA immaturi e può essere importante per l'impilamento delle basi con i substrati. Il motivo IV C-terminale è unico per le proteine ​​DUF1814 e si propone che formi un sito catalitico con il motivo III26,27. Ad oggi, la tossina MenT3 è il membro meglio caratterizzato di questa famiglia. È stato dimostrato che MenT3 (chiamato anche TglT) inibisce la traduzione trasferendo le pirimidine all'estremità 3' CCA degli steli accettori di tRNA (preferenzialmente al Ser-tRNA in vitro), prevenendo così un'ulteriore aminoacilazione25. Sorprendentemente, è stato suggerito che tale attività venga neutralizzata dall'antitossina MenA3 che agisce come una specifica chinasi che fosforila MenT3 nel residuo del sito catalitico Ser7827. Questa modalità di inibizione proposta ha portato alla classificazione di MenAT3 come sistema TA di tipo VII3,28. Le strutture ai raggi X di MenT3 e MenT4 mostrano che entrambe sono proteine ​​globulari monomeriche, bilobate, con somiglianza nella loro piega complessiva, specialmente nel loro presunto sito attivo25. Inoltre, le strutture dell'antitossina MenA4 e dell'omologo stretto AbiEi rivelano la presenza di domini di legame del DNA elica-giro-elica alati N-terminali collegati da un breve linker ai domini chinasici C-terminali coinvolti nella neutralizzazione della tossina29,30,31. In vivo, è stato dimostrato che menAT2 viene indotto dall'esposizione allo stress nitrosativo ed è necessario per la patogenesi del M. tuberculosis nelle cavie32. Al contrario, non si sa praticamente nulla di MenAT1. Il sistema MenAT1 codifica la prevista proteina tossina NTasi-simile MenT1 (che condivide il 15% di identità di aminoacidi con MenT3) insieme ad una presunta antitossina molto breve di 68 aminoacidi, denominata MenA1, originariamente identificata come una presunta tossina di tipo I SymE-simile e prevista essere disordinato e privo di un dominio di legame del DNA12. Lavori precedenti hanno dimostrato che MenT1 è tossico quando espresso in M. smegmatis e che la sua tossicità è stata efficacemente inibita da MenA125 co-sovraespresso. Curiosamente, la sovraespressione di MenT1 non ha mostrato tossicità rilevabile in E. coli, il che è in netto contrasto con MenT3 o AbiEii25,33.