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Nature Communications volume 14, numero articolo: 1455 (2023) Citare questo articolo

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Identificare il modo in cui le piccole molecole agiscono per uccidere i parassiti della malaria può portare a nuovi obiettivi “convalidati chimicamente”. Facendo pressione sui parassiti allo stadio sanguigno asessuale di Plasmodium falciparum con tre nuovi composti antimalarici strutturalmente non correlati (MMV665924, MMV019719 e MMV897615) ed eseguendo l'analisi della sequenza dell'intero genoma su linee di parassiti resistenti, identifichiamo mutazioni multiple nella sintetasi acil-CoA di P. falciparum ( ACS) geni PfACS10 (PF3D7_0525100, M300I, A268D/V, F427L) e PfACS11 (PF3D7_1238800, F387V, D648Y ed E668K). La sostituzione allelica e la profilazione termica del proteoma convalidano PfACS10 come bersaglio di questi composti. Dimostriamo che questa proteina è essenziale per la crescita del parassita mediante atterramento condizionale e osserviamo una maggiore suscettibilità al composto in caso di ridotta espressione. L'inibizione di PfACS10 porta ad una riduzione dei triacilgliceroli e ad un accumulo dei suoi precursori lipidici, fornendo informazioni chiave sulla sua funzione. L'analisi del gene PfACS11 e delle sue mutazioni indica un ruolo nella mediazione della resistenza attraverso una ridotta stabilità proteica.

Nonostante i notevoli progressi verso l’eliminazione della malaria, il World Malaria Report 2022 stima in 247 milioni di nuovi casi e 619.000 decessi attribuibili alla malaria nel 20211. Per trattare la malattia viene utilizzato un numero limitato di classi di farmaci antimalarici e un certo grado di resistenza a quasi tutti gli agenti terapeutici si è verificato in almeno alcune popolazioni di parassiti Plasmodium falciparum in aree endemiche. L’identificazione di nuovi antimalarici che mirano a nuovi percorsi è essenziale per aumentare il repertorio di farmaci disponibili.

Negli ultimi dieci anni, più di 5 milioni di composti sono stati sottoposti a screening fenotipico contro P. falciparum e sono stati identificati oltre 25.000 risultati con attività bassa o submicromolare2,3,4,5,6,7. L’identificazione di bersagli validati chimicamente di questi composti colpiti può catalizzare l’uso di approcci potenti come la scoperta di farmaci guidati dalla struttura, lo screening di frammenti o librerie codificate dal DNA per accelerare la scoperta e lo sviluppo di farmaci contro la malaria. Il consorzio Malaria Drug Accelerator (MalDA) cerca di identificare nuovi bersagli farmacologici nel P. falciparum tramite un approccio chemogenomico8, concentrandosi su piccole molecole identificate come risultati positivi nello screening fenotipico della cellula intera. Una delle principali strategie di questo consorzio è quella di applicare l'evoluzione in vitro di parassiti resistenti e il sequenziamento di prossima generazione ad alto rendimento, che ha identificato molteplici nuovi bersagli e meccanismi di resistenza9,10,11,12.

Qui sfruttiamo i rapporti precedenti di esperimenti di evoluzione della resistenza in vitro con tre scaffold chimici distinti (MMV665924, MMV019719 e MMV897615) per ottenere nuove informazioni sugli obiettivi farmacologici candidati PfACS10 e PfACS11, membri conservati della P. falciparum acil-CoA sintetasi (PfACS) famiglia degli enzimi8,12,13. Gli enzimi PfACS sono molto simili alle sintetasi degli acidi grassi a catena lunga (ACSL), che attivano gli acidi grassi liberi (FA) di una catena acilica preferita di 12-20 accoppiandoli al coenzima A in un processo in due fasi, dipendente dall'ATP , risultando in acil-CoA14. Gli ACSL eucariotici mostrano preferenze per lunghezze e gradi di saturazione specifici del substrato FA15,16,17,18. I parassiti eliminano gli FA dall'ospite19,20 e l'attivazione degli FA da parte delle PfACS consente loro di essere incorporati in varie specie lipidiche essenziali per la crescita dei parassiti. Ciò include l'accumulo di lipidi neutri (triacilgliceroli e diacilgliceroli) nelle goccioline lipidiche21,22.

Utilizzando la sostituzione allelica e la profilazione del proteoma termico, forniamo qui la prova che PfACS10 è una proteina essenziale e il bersaglio di MMV665924, MMV019719 e MMV897615. L'inibizione di PfACS10 porta ad una riduzione dei triacilgliceroli e ad un accumulo dei suoi precursori lipidici. D'altra parte, mentre la sostituzione allelica delle mutazioni in PfACS11 fenocopia le linee selezionate, i nostri dati di knockdown condizionale dimostrano che PfACS11 non è essenziale per la crescita asessuata del parassita, il che implica che PfACS11 potrebbe mediare la resistenza piuttosto che essere un bersaglio diretto.

0.01 from globally diverse isolates (www.malariagen.net/pf3k). The length of the bars represents the local MAF of each variant in West (blue) or East (purple) Africa. The selected variants are indicated by red, blue, and yellow arrows. Dark green boxes indicate the ACS motifs: P: P-loop, G: Gate motif, A: Adenine binding site, L: Linker. c Representative dose-response assay for a clonal line of CF04.008 (ACS10 M300, gray) and two clonal lines of CF04.009 (ACS10 M300I, red) from Malawi. Assays were run in triplicate and repeated twice. Shown are the average ±SD and the non-linear regression curve fit for one biological assay run in triplicate. Source data are provided as a Source Data file. MAF minor allele frequency, π pairwise nucleotide diversity within each country, FST divergence./p>0.01 are depicted in orange (Fig. 3 and Supplementary 4). Resistance-associated mutations are depicted in red./p>43% coverage of the P. falciparum proteome. This compares favorably with the coverage reported for previous TPP and cellular thermal shift assays coupled with mass spectrometry (MS-CETSA) studies with P. falciparum37,38. TPP datasets were analyzed using the standard melting temperature (Tm)-based method, as described in an earlier TPP publication39. This analysis assesses individual protein melt curves using several criteria including curve R2, variability in Tm values within the control sample, maximum curve plateau, and minimum slope. Melting point differences (ΔTm = Tm, treated–Tm, control) are then established for every detectable protein. Only the most significantly affected proteins are selected as potential “hits” by applying an FDR-adjusted z-test to ΔTm data. Proteins with a p-value <0.1 in two separate technical replicates are considered “hits”. Hits found in two biological replicas are considered as putative targets./p>

1.5, mapping quality > 40, min base quality score > 18, read depth > 5) to obtain high quality SNPs that were annotated using SnpEff version 4.3t68. BIC-Seq version 1.1.269 was used to discover copy number variants (CNVs) against the parental strain using the Bayesian statistical model. SNPs and CNVs were visually inspected and confirmed using Integrative Genome Viewer (IGV). All gene annotations in the analysis were based on PlasmoDB-48_Pfalciparum3D7 (https://plasmodb.org/plasmo/app/downloads/release-48/Pfalciparum3D7/gff/)./p>25% of samples, or showed high levels of heterozygosity within single infections (>25%). Additionally, 558 genes failed gene-level quality filters (≥20% heterozygous calls or ≥20% missing calls across samples) and were removed from the analysis. Calculations of pairwise nucleotide diversity (π) and Weir and Cockerham’s FST estimator were performed the PfalGeneDiversityStats package71./p>0.8. The statistical significance was calculated using a z-test and only proteins with a p-value < 0.2 in both technical replicates were considered hits. Hits found in two biological replicates were considered putative targets. Alternatively, we used the NPARC method (non-parametric analysis of response curves), a strategy that compares the experimental data to two models: a null model that assumes that drug has no influence on the protein melting behavior, and an alternative model that assumes that drug affects the melting behavior. Any data-driven adjustments to these models were calculated and assessed for statistical significance using an F-test, generating a p-value. All TPP datasets generated with MMV897615 have been deposited to the ProteomeXchange Consortium via the PRIDE partner repository77 under the identifier PXD034937./p>